La construcción del Monasterio fue acometida por Felipe II en cumplimiento de dos promesas. La primera ejecutar el testamento del Emperador Carlos, en donde se le confiaba la tarea de buscar una sepultura para él y la emperatriz Isabel, y la segunda consumar la ofrenda efectuada tras la victoria en la Batalla de Saint-Quentin el 10 de agosto de 1557 contra las tropas francesas.

Su edificación comenzó en el año 1563 bajo la dirección de Juan Bautista de Toledo y se prolongó hasta 1584, siendo Juan de Herrera el arquitecto responsable de la finalización de las obras. A él se debe el estilo que define a este gran complejo monacal y palaciego en el que queda plasmada la transición del plateresco renacentista a un mayor clasicismo desnudo de ornamentación. El resultado es un edificio monumental, de planta rectangular y una superficie cercana a los 35.000 metros cuadrados, en el que destacan la unidad de estilo, la jerarquización y la relación entre las distintas partes que lo componen.

Todo el conjunto se articula en torno a la Basílica, de planta cuadrada y coronada por una gran cúpula de 17 metros de diámetro. En su interior destaca la Capilla Mayor, cuyo retablo, realizado en mármol y jaspe contiene esculturas de Leone y Pompeo Leoni y pinturas de Tibaldi y Zúccaro. Bajo el Altar Mayor se encuentra la cripta o Panteón de los Reyes, una estancia de forma octogonal cubierta con una cúpula y una decoración de estilo barroco que alberga los restos de todos los monarcas españoles desde Carlos I hasta Alfonso XIII, con las excepciones de Felipe V y Fernando VI.

Alrededor del presbiterio de la Basílica se sitúa el Palacio de los Austrias, cuya construcción sigue el mismo esquema del Palacio de Carlos V en Yuste. En esta zona pueden visitarse los Cuartos Reales y la Sala de las Batallas, una galería alargada decorada con frescos que recrean escenas de batallas como San Quintín, Higueruelas, Pavía o Lepanto.

El tercio sur del conjunto está ocupado por el Monasterio, organizado en torno al claustro principal, denominado Patio de los Evangelistas, en el que destaca el templete realizado por Herrera en granito, mármoles y jaspes de diferentes colores, así como la escalera que comunica las dos plantas, cuyas bóvedas están decoradas por frescos de Lucas Jordán. También en la zona monástica encontramos las Salas Capitulares y la Real Biblioteca.

Otro de los elementos sobresalientes del Monasterio es el Museo de Arquitectura y Pintura que alberga obras de grandes pintores de los siglos XV al XVII, como El Bosco, Durero, Tiziano, Tintoretto, Valdés Leal, Velázquez, Rubens o el Greco.